Expertises du CNR des Staphylocoques
Identification de souches
Les souches de staphylocoques posant des problèmes d'identification peuvent être envoyées au CNR pour confirmation ou détermination de l’identification. Elles seront identifiées :
- par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Vitek-MS, bioMérieux)
- par technique moléculaire si nécessaire : séquençage du génome complet
Détection des gènes de toxines (profil toxinique)
La détermination des profils toxiniques est effectuée uniquement pour S. aureus (pour les S. non-aureus, prendre contact avec le CNR en cas de présentation clinique atypique) :
- par séquençage du génome complet ou par puces à ADN (InterArray)
- le polymorphisme de l’opéron de gènes agr « accessory gene regulator » ainsi que les gènes de résistance à la méticilline (mecA, mecC) sont également recherchés par PCR multiplex
Détection directe des toxines
En cas d'intoxication alimentaire, les entérotoxines A à E sont recherchées dans les vomissements des patients par une méthode immuno-enzymatique ELISA, RIDASCREEN ®.
Il ne faut pas faire parvenir au CNR de souches isolées de ces prélèvements. Par ailleurs, pour le diagnostic de TIAC, nous rappelons qu'il ne faut pas envoyer de souches isolées de coproculture et que les aliments doivent être envoyés aux services vétérinaires après avis de l'ARS.
Recherche de lien de clonalité
En cas de suspicion de transmission croisée ou d’épidémie, une recherche de clonalité est effectuée par séquençage du génome complet pour les S. aureus et les staphylocoques non-aureus. Les séquences obtenues sont ensuite analysées phylogénétiquement afin de confirmer ou d’infirmer les liens épidémiologiques entre les différentes souches bactériennes.
Résistance aux antibiotiques
Confirmation/détermination du phénotype de résistance
En cas de de demande d’expertise concernant la résistance aux antibiotiques, le CNR réalise un antibiogramme par microdilution (plaque Sensititre, ThermoFisher). Cette plaque permet notamment de tester les marqueurs de la résistance à la méticilline (céfoxitine, oxacilline), les céphalosporines anti-SARM (ceftaroline, ceftobiprole), les aminosides, les macrolides et apparentés, les fluoroquinolones, les glycopeptides (vancomycine, teicoplanine), la daptomycine, la dalbavancine et les oxazolidinones (linézolide, tédizolide).
Le CNR dispose aussi des techniques d’antibiogramme classiques en milieu liquide (Vitek2, bioMérieux) et en milieu solide (diffusion sur milieu gélosé par la méthode des disques ou des bandelettes en gradient).
Détection de la résistance aux bêta-lactamines
- Détection des gènes mecA/mecC : Les gènes de résistance à la méticilline (mecA/mecC) sont recherchés par PCR pour toutes les souches de S. aureus et de staphylocoques non-aureus reçues au CNR.
- Détection immunochromatographique de la PLP2a : Le test PBP2a SA Culture Colony Test (Abbott) est disponible au CNR pour la recherche sur souche de S. aureus de l’expression de la PLP2a codée par le gène mecA.
- Détection de la bêta-lactamase staphylococcique : La pénicillinase de S. aureus peut être recherchée phénotypiquement (disque de pénicilline G) ainsi que par détection moléculaire du gène blaZ.
Détection de la résistance aux glycopeptides :
Elle est effectuée seulement pour S. aureus. Les souches de staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont refusées.
Le CNR réalisait auparavant la recherche de sensibilité diminuée aux glycopeptides par une première étape de criblage (« macroEtests », utilisant un inoculum lourd de 2 McF sur gélose cœur cervelle), puis une étape de confirmation par analyse de population sur des géloses cœur cervelle contenant des concentrations croissantes de vancomycine. Ces techniques ont été décrites de manière historique dans les années 1990 mais leurs résultats n’ont jamais été formellement associés à l’efficacité thérapeutique de la vancomycine et sont donc peu contributifs pour l’adaptation thérapeutique. De plus, elles présentent une faible reproductibilité et sont fastidieuses avec un long délai de réponse. De ce fait, ces techniques de recherche des hétéroGISA ont été récemment abandonnés.
Actuellement, le CNR réalise seulement une vérification des CMI des glycopeptides en microdilution pour les souches de S. aureus. En effet, c’est la CMI vancomycine qui est le plus prédictif de la probabilité de succès ou d’échec, avec une CMI >1 mg/L associée à un risque plus élevé d’échec thérapeutique comme indiqué dans les recommandations du CA-SFM/EUCAST depuis 2023.
Les souches de S. aureus résistantes à haut niveau à la vancomycine sont rarissimes et n’ont jamais été décrites en France. La détection du gène vanA par PCR ou séquençage du génome complet peut cependant être effectuée après avis d’un biologiste du CNR.
Détermination des mécanismes de résistance au linézolide
Elle repose sur la détermination de la CMI du linézolide et du tédizolide avec une incubation de 48h (par microdilution en technique Sensititre ou par technique de bandelette en gradient type Etest) associée à la recherche des déterminants génétiques qui aboutissent à la modification du site de liaison du linézolide au ribosome. Les mécanismes de résistance au linézolide transférables (cfr/cfr(B), optrA et poxtA) sont recherchés par PCR multiplex et les mutations dans la séquence de l’ARNr 23S et/ou des protéines ribosomales L3 et L4 sont détectées par séquençage du génome complet. Le CNR surveille plus particulièrement les résistances au linézolide chez S. aureus et les résistances de bas niveau, souvent liées à des mécanismes de résistance transférables entre souches.
Détection d'autres résistances :
La recherche de la résistance à la daptomycine, la ceftaroline, la dalbavancine, les macrolides, la mupirocine ou d’autres antibiotiques peut être effectuée au CNR sur demande. Lorsqu’il s’agit d’une simple demande de détermination de CMI pour une molécule pour laquelle il existe des réactifs commercialisés, le CNR se réserve le droit de refuser ou de facturer la prestation.
En cas de besoin, le CNR dispose de diverses techniques moléculaires (puces à ADN, séquençage Illumina et Nanopore) lui permettant de déterminer le résistome des souches et d’explorer les mécanismes à l’origine d’un phénotype de résistance particulier lorsqu’il existe des données dans la littérature.
Sérologies (TSST-1 et PVL)
Le CNR a développé deux techniques sérologiques pour l’aide au diagnostic et le suivi des pathologies associées à la leucocidine de Panton Valentine (PVL) et à la toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1).
Technique et performances
Les anticorps sériques dirigés contre la PVL ou la TSST-1 sont quantifiés par méthode ELISA et comparés à un calibrateur stable issu d’un pool de donneurs sains. Les seuils décisionnels et les performances analytiques de ces méthodes ont été déterminés en comparant les taux d’anticorps anti-PVL et anti-TSST-1 : (i) dans une population de témoins sains (patients adultes donneurs de sang, n=200) ; (ii) chez des patients présentant une infection à S. aureus PVL-positif (n=24) ; et (iii) chez des patientes présentant un syndrome de choc toxique staphylococcique menstruel (MTSS) (n=6). Les taux d’anticorps ont été exprimés en unités arbitraires (UA/mL), 1000 UA/mL représentant le taux observé pour des immunoglobulines humaines polyclonales (Tégéline®) à 12,5 g/L.
Sérologie PVL. Les taux moyens d’anticorps anti-PVL chez les témoins et les patients infectés à S. aureus PVL-positif étaient respectivement de 1534 UA/mL et 40873 UA/mL. La courbe ROC et l’indice de Youden ont permis de définir un seuil décisionnel (>4900 UA/mL) permettant le diagnostic rétrospectif d’infection à S. aureus PVL-positif avec une sensibilité et une spécificité supérieures à 90% dans la population française.
Sérologie TSST-1. Le taux moyen d’anticorps anti-TSST-1 chez les témoins était de 1282 UA/mL. Un taux de 0 UA/mL était retrouvé chez 100 % des patientes ayant présenté un MTSS, contre seulement 5 % des témoins (n=10 sur 200), et 9,4% des femmes de 18 à 40 ans (n=5 sur 53). Face à une clinique évocatrice, l’absence d’anticorps anti-TSST-1 à la phase aigüe du choc est donc en faveur du diagnostic de MTSS.
Indications et interprétation de ces sérologies
La PVL est associée à des infections suppuratives sévères, dont la pneumonie nécrosante, et la TSST-1 au choc toxique staphylococcique menstruel (MTSS), chez la femme jeune ne possédant pas d’anticorps neutralisants contre cette toxine, et au choc toxique non menstruel (NMTSS).
Si l’isolement des souches de S. aureus responsables des signes cliniques doit demeurer un objectif prioritaire, nous avons montré que ces deux sérologies constituent des outils rétrospectifs pouvant concourir au diagnostic de certaines infections toxiniques staphylococciques. Elles sont contributives lorsqu’un diagnostic direct est impossible (notamment lors de traitement antibiotique précoce ayant pu négativer les prélèvements bactériologiques), ainsi que pour estimer le risque de récidive de MTSS en cas de persistance d’une séronégativité.
Sérologie PVL. Elle peut présenter un intérêt dans les pneumopathies nécrosantes non documentées, même si la cinétique de séroconversion est encore mal connue.
Sérologie TSST-1. L’absence d’anticorps à la phase aigüe du choc en période menstruelle est en faveur d’un choc toxique staphylococcique ; le suivi sérologique permet d’observer une absence de séroconversion chez la majorité des patientes. Or, la persistance d’un taux négatif à distance de l’épisode de choc est associée à un risque accru de récidive et conduit donc à conseiller aux femmes concernées de ne pas utiliser des tampons vaginaux ou des coupes menstruelles.
Prélèvements
Dans tous les cas, pour que la sérologie soit interprétable, il convient, dans la mesure du possible, de nous envoyer un sérum précoce (au moment du début des symptômes) puis un sérum tardif (au moins 3-4 semaines après le début des symptômes) afin de pouvoir objectiver une séroconversion ou une absence de séroconversion.
Conservation des souches
Toutes les souches de staphylocoques reçues pour expertise et analysées sont conservées au CNR.